华重楼Paris polyphylla var. chinensis为百合科Liliaceae重楼属Paris多年生草本植物^[1-2]，其根状茎具有消肿止痛、清热解毒、定惊凉肝等功效，可用于治疗毒蛇咬伤、跌打伤痛、咽喉肿痛、惊风抽搐等病症。华重楼是一种传统名贵中药，与滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis一起作为重楼药材的法定基原收载于《中国药典》^[3-4]。华重楼于每年4月抽薹开花，6—7月初果，9—10月果实成熟，果实为蒴果，成熟时自然开裂，露出带红色外种皮的种子，去除外种皮后的种子白色，呈卵球状，平均直径2.5～4.5 cm^[5]。由于华重楼果实成熟后，其种子并未发育完全，具有休眠特性，种子在自然情况下萌发时间长，发芽率低^[6]。为打破种子休眠，许多学者对华重楼种子休眠^[7-9]、后熟^[10]及萌发阶段^[11]生理生化变化进行了深入而广泛的研究。由于影响种子萌发的因素复杂，目前对华重楼种子萌发的机制尚不明确，有研究表明华重楼的种子休眠可能与种皮中含有萌发抑制物和胚休眠共同作用有关^[12-13]。王跃华等^[14-15]的研究表明华重楼种子外种皮水提液对青菜、榨菜和白菜种子萌发和幼苗的生长都具有明显的抑制作用，对种子萌发产生不利影响，去外种皮的华重楼种子经适宜浓度的H₂O₂与GA溶液处理后，可有效解除种子休眠，缩短种子的萌发时间。综上表明外种皮对种子萌发具有一定的抑制作用。然而，关于外种皮对华重楼种子贮藏过程中生理生化指标的影响研究未见报道。本文以带外种皮和去外种皮两种不同处理方式的种子，在相同条件下进行室外贮藏，研究贮藏过程中抗氧化酶活性、活性氧及多种激素等相关生理生化指标的变化，分析外种皮对各项生理指标变化的影响及其在华重楼种子萌发过程中的作用，旨在为发现华重楼种子适宜的贮藏方法提供理论参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验用种子采自浙江省丽水市遂昌县白马山林场（119°08′7.66″E，28°37′30.28″N，海拔1 199 m）种植的6年生华重楼基地。2022年10月种子成熟后，随机采集大小一致、健康无病虫害的果实。

1.2   试验方法

1.2.1   种子处理与贮藏

将采收后的果实室温堆置15～20 d，去除果皮，收集带有红色种肉的种子。然后将种子分成2种处理后进行自然条件下室外贮藏，一种为搓去红色外种皮，洗净；另一种为保留外种皮直接贮藏。贮藏时将种子与适量基质拌匀后装入种子袋，所用基质为镇江市京口区绿岛园艺开发中心提供的植物培养基（浮玉牌），pH 6.5～7。每种处理种子量约为400 g，根据种子休眠程度选择不同贮藏时间（4个月、8个月、10个月）分别取出100 g左右进行指标测定。每个处理重复3次，且每个样品的生理生化指标重复测定3次。

1.2.2   生理生化指标测定

过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化氢含量（H₂O₂）、超氧阴离子、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等生理指标采用试剂盒法测定。测定方法按照每种试剂盒所附货号的说明书进行。各试剂所附货号见表1。所有试剂盒均购自南京集测生物科技有限公司。

表  1  试验用试剂盒所附货号

Table  1.  Product code attached to the test kit

试剂盒	过氧化物酶	过氧化氢酶	丙二醛	过氧化氢	超氧阴离子	超氧化物歧化酶	苯丙氨酸解氨酶
货号	JC0102-S	JC0103-S	JC0202-M	JC0201-M	JC0203-M	JC0101-M	JC0114-M

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1.2.3   激素含量测定

激素测定参考陈疏影等^[16]的方法进行。

1.2.3.1   激素提取

取种子样本置于10 mL 离心管，放置于冻干机内冻干，称取冻干后样品质量约0.5 g，置于10 mL 离心管，加入5 mL 提取液（甲醇∶水∶甲酸，体积比：15∶4∶1；含0.5% BHT），漩涡混合1 min，研磨5 min，超声振荡30 min，−4 ℃静置60 min，12 000 r·min⁻¹离心10 min；取出上清液进入SPE 固相萃取柱（流速≤1 mL·min⁻¹）进行固相萃取（淋洗：3 mL 水、10%甲醇水；洗脱：3 mL 甲醇）。将上述洗脱液放于浓缩机内浓缩至干，用0.20 mL 80%甲醇水复溶，漩涡混合5 min，12 000 r·min⁻¹离心10 min，移取上清液上机进样作LC-MS/MS 分析。

1.2.3.2   激素测定

液相色谱Waters Acquity UPLC，质谱AB SCIEX 5500 Qtrap -MS，色谱柱：Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm， 2.1 mm ×100 mm），色谱分离条件：柱温：30 ℃，流速：0.30 mL·min⁻¹。流动相组成：A-水（0.05%甲酸），B-乙腈（0.05%甲酸）。运行时间：10 min，进样量：6 μL，样本梯度洗脱程序见下表2。

表  2  样本梯度洗脱程序

Table  2.  Sample gradient elution procedure

时间/min	流速/（ mL·min−1）	B/%	进样量/μL
初始	0.300	10	初始
1.00	0.300	10	6
7.00	0.300	70	6
8.00	0.300	70	6
9.00	0.300	10	6
10	0.300	10	6

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质谱条件：离子源（Ion source）：ESI 离子源；气帘气（Curtain Gas）：35 arb；碰撞气（Collision GAS）：9 arb；离子喷雾电压（IonSpray voltage）：4500V；离子源温度（Temperature）：450 ℃；离子源气体（IonSource Gas1）：55 arb；离子源气体（IonSource Gas2）：55 arb。

1.2.3.3   标准曲线的绘制

准确取标准溶液（10.0 μg·min⁻¹）0.1 mL，用80%甲醇水定容至1.00 mL 配制成浓度1000 mg·L⁻¹标准使用溶液，用80%甲醇水稀释成相应浓度的标准系列溶液。标准溶液现用现配。根据不同浓度及相应浓度下标品的峰面积绘制出标准曲线（表3）。由表3可知R²均大于0.99，说明标准曲线的线性关系较好，可用于样本中植物激素浓度的计算。

表  3  13种激素标样测得标准曲线

Table  3.  The standard curves of 13 hormone samples

激素名称	标准曲线	R2		激素名称	标准曲线	R2
脱落酸	y=30 967.53x+3 177.78	0.9997		反式玉米素	y=53 534.29x+8119.76	0.9999
赤霉素3	y=30 269.09x+701.66	0.9990		茉莉酸	y=5 256.01x+4436.27	0.9997
1-萘乙酸	y=20 842.99x+3458.17	0.9999		玉米素核苷	y=459 357.93x+7066.56	0.9998
激动素	y=102 297.84x+4436.33	1.0000		褪黑素	y=2 074 694.85x+67295.72	0.9999
赤霉素7	y=199 297.72x+3 412.59	0.9999		二氢玉米素	y=204 765.05x+9982.9	0.9999
水杨酸	y=397 650.01x+5458.01	0.9998		利波腺苷	y=611 823.72x+5044.01	0.9998
吲哚乙酸	y=18 132.95x+2 869.8	0.9997

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1.3   数据处理

试验结果利用Microsoft Excel 2003进行统计和制图。生理指标采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和显著性检验（LSD检验）。

2.   结果与分析

2.1   华重楼种子贮藏过程中抗氧化酶活性的变化

2.1.1   SOD活性

由图1可知，贮藏前（0 d）带种皮种子的SOD活性显著大于去种皮种子。2种不同处理种子的SOD活性均随贮藏时间延长而下降，在贮藏后4个月下降明显。其中，带种皮种子的SOD活性在贮藏至第4、8和10个月时分别下降了56.67%、62.94%、67.88%，去种皮种子分别下降了44.08%、47.84%、45.83%，贮藏4个月以后基本保持稳定，且带种皮种子的SOD活性下降幅度明显大于去种皮种子，贮藏至10个月时，去种皮种子的SOD活性显著大于带种皮种子。

图  1  贮藏过程华重楼种子SOD、POD、CAT和PAL活性变化

注：图中不同小写字母表示同一处理不同贮藏时间段差异显著（P<0.05），不同大写字母表示相同时间段不同处理间差异显著（P<0.05）；下同。

Figure  1.  Changes of SOD、POD、CAT and PAL of P. polyphylla seeds during storage

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2.1.2   POD活性

贮藏前带种皮种子POD活性显著高于去种皮种子，但在贮藏过程中两者变化规律不一致，带种皮种子表现出先降后升的趋势，而去种皮种子表现出先上升后降的趋势。在贮藏至第4、8和10个月带种皮种子的POD活性分别下降了33.46%、23.59%、14.25%，而去种皮种子分别上升了33.46%、23.59%、14.25%。贮藏240 d、300 d的带种皮种子的POD活性高于去种皮种子。

2.1.3   CAT活性

贮藏前去种皮种子的CAT活性要显著高于带种皮种子，且随着贮藏时间的延长，两者均表现出先降后升的变化规律，带种皮种子在贮藏4和8个月后其活性分别下降了50.61%和46.33%，贮藏10个月后又快速上升，其活性较贮藏前高出1.22%，但差异不显著。去种皮种子在贮藏4和8个月后其活性先分别下降了65.39%和57.64%，贮藏至10个月后快速上升，但仍较贮藏前低11.22%，且差异显著。贮藏过程中去种皮种子的CAT活性的下降幅度大于带种皮种子，但总体上去种皮种子的CAT活性仍要大于带种皮种子，除了贮藏8个月时间段两者无显著差异外，其余时间段均有显著差异。

2.1.4   PAL活性

贮藏前带种皮种子的PAL活性比去种皮种子高17.44%，差异显著。随贮藏时间的延长，2种不同处理种子的PAL活性均呈下降趋势，带种皮种子的PAL活性在贮藏4、8和10个月后分别下降了25.77%、31.92%、34.23%，而去种皮种子分别下降了11.90%、14.34%、19.31%，贮藏过程带种皮种子的PAL活性下降幅度明显大于去种皮种子。贮藏过程中两者的PAL活性趋于接近，在各贮藏时间段内差异不显著。

2.2   华重楼种子贮藏过程中活性氧的变化

2.2.1   超氧阴离子

超氧阴离子（O₂⁻）是一种活性氧，在细胞的氧化还原代谢中发挥重要作用^[17]。当生物体内超氧阴离子的累积超过细胞所能调节的范围时，可能会引起细胞坏死、DNA损伤、脂质过氧化等^[18]。贮藏前去种皮种子的超氧阴离子含量显著高于带种皮种子，在贮藏过程中两者均表现出先升后降的变化趋势（图2）。带种皮种子在贮藏4和8个月后O₂⁻含量分别上升59.16%、65.08%，与贮藏前差异显著，而后又快速下降，贮藏至10个月其含量超出贮藏前12.02%，但差异不显著。去种皮种子的超氧阴离子含量在贮藏前4个月快速上升，而后又缓慢下降，贮藏4和8个月其含量分别上升52.53%、25.94%，贮藏10个月后其含量较贮藏前低7.2%，但差异不显著。总体上去种皮种子的超氧阴离子含量高于带种皮种子。

图  2  贮藏过程华重楼种子超氧阴离子及H₂O₂含量变化

Figure  2.  Changes of superoxide anion and H₂O₂ of P. polyphylla seeds during storage

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2.2.2   H₂O₂

过氧化氢 （H₂O₂） 是 ROS 代谢的产物，在低浓度水平时作为信号分子，促进种子萌发、气孔开放，提高叶绿素含量，延缓衰老^[19]，改善植物在逆境胁迫下的生长发育情况和抗氧化防御能力^[20]。贮藏前去种皮种子的H₂O₂含量显著高于带种皮种子，但在贮藏过程中两者表现出不一样的变化趋势（图2）。带种皮种子的H₂O₂含量在贮藏前最低，随贮藏时间的延长，其含量逐渐上升，贮藏前4个月上升较快，贮藏后期上升不明显，在贮藏4、8和10个月后其含量较贮藏前分别上升54.00%、59.33%、56.02%，而去种皮种子的H₂O₂含量在贮藏前为最高，随贮藏时间的延长，其含量逐渐下降，在贮藏4、8和10个月后其含量分别下降20.20%、16.72%、14.34%，贮藏10个月时，带种皮种子的H₂O₂含量已超过去种皮种子，且差异显著。

2.3   华重楼种子贮藏过程中内源激素含量变化

2.3.1   生长素、赤霉素

由图3可知，贮藏前期去种皮种子的生长类激素吲哚乙酸含量变化不明显，贮藏4个月后快速上升，贮藏8个月时含量最高，与贮藏前相比上升了61.07%，贮藏至10个月后又稍有下降，但差异不明显。生长类激素1-萘乙酸、赤霉素3和赤霉素7的含量均随贮藏时间的延长而呈下降趋势，在贮藏前4个月下降明显，与贮藏前有显著差异，贮藏后期各含量相对稳定，下降均不明显。从2种处理种子的4种生长类激素含量来看，吲哚乙酸含量相对高于其他激素含量，且带种皮种子的吲哚乙酸含量（除贮藏4个月外）均显著高于去种皮种子，其他激素含量差异不显著。说明生长类激素吲哚乙酸可能是促进种子萌发的重要内源激素之一，保留外种皮有利于其含量升高。

图  3  贮藏过程华重楼种子生长类激素及赤霉素含量变化

Figure  3.  Changes of auxin hormones and gibberellin in P. Rhizoma seeds during storage

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2.3.2   细胞分裂素

由图4可知，贮藏前带种皮种子中的4种细胞分裂素（反式玉米素、玉米素核苷、二氢玉米素、激动素）含量显著高于去种皮种子。去种皮种子的细胞分裂素玉米素核苷、二氢玉米素和激动素含量随贮藏时间的延长而下降，贮藏10个月时分别下降了31.17%、14.62%、70.49%，而反式玉米素略有上升，贮藏10个月时上升了16.47%。带种皮种子中4种细胞分裂素随着贮藏时间的增加含量均显著下降。细胞分裂素在植物的生长过程中促进细胞的分裂，在种子贮藏过程中含量大幅下降。

图  4  贮藏过程华重楼种子细胞分裂素含量变化

Figure  4.  Changes of cytokinin in P. Rhizoma seeds during storage

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2.3.3   茉莉酸和水杨酸

图5显示，贮藏前2种处理的脂类激素茉莉酸、酚酸类激素水杨酸含量均最高，去种皮种子中的含量显著高于带种皮种子。贮藏后2种处理的脂类激素茉莉酸、酚酸类激素水杨酸含量显著下降，而贮藏过程其含量无显著差异。贮藏至10个月时带种皮种子的含量大于去种皮种子，茉莉酸含量有显著差异，水杨酸含量差异不显著。

图  5  贮藏过程华重楼种子茉莉酸和水杨酸含量变化

Figure  5.  Changes of jasmonic acid and salicylic acid in P. Rhizoma seeds during storage

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2.3.4   ABA

贮藏前带种皮种子的脱落酸含量显著低于去种皮种子，贮藏后先快速上升，然后下降，之后又稍有上升。去种皮种子的脱落酸含量随贮藏时间的延长呈显著下降趋势，贮藏4、8和10个月后分别下降了65.77%、87.60%、89.00%，贮藏后期下降幅度减小（图6）。脱落酸能使种子进入休眠状态^[21]，带皮贮藏前期（4个月）含量显著上升，这说明种子进入休眠状态，后期休眠稳定期（8—10个月），含量下降。

图  6  贮藏过程华重楼种子脱落酸含量变化

Figure  6.  Changes of abscisic acid in P. Rhizoma seeds during storage

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3.   结论与讨论

3.1   讨论

研究表明华重楼种子具有休眠特性，果实成熟后，其种子并未发育完全，种胚具有明显的后熟现象^[21]。自然情况下华重楼果实于9月下旬左右成熟，经10个月左右于次年8～9月份完成种胚的形态后熟，再经过第2年冬季低温打破胚轴的休眠，到第3年2～3月份子叶岀苗。生产上为保持种子的生活力和发芽率，通常采取相应的种子贮藏和后熟处理^[22]。大多数种子在贮藏和生理后熟期间会发生一系列的生理生化变化，如储藏物质的转化、酶活性的变化、有毒物质的积累、多种激素水平的调控等^[10,23-24]。生理生化指标的变化，可以揭示影响种子活力和萌发的因素，从而为探寻种子的萌发条件和采取相应的技术措施提供依据。李昭玲等^[13]通过对变温层积处理过程中华重楼种子SOD、POD、CAT、MDH、G-6-PDH等5种酶活性的变化研究发现，华重楼种子在经过层积处理进入第40～60天后，G-6-PDH迅速上升，MDH下降，SOD、CAT活性在整个层积过程中始终维持一定水平，POD在进入低温层积后显著上升，为华重楼种子通过调控种子呼吸代谢途径，促进种子解除休眠提供理论指导。SOD、POD、CAT是植物体内酶促清除系统中重要的抗氧化活性酶，其活性水平的高低可以反映植物种子的活力水平。本试验2种处理的种子在贮藏过程中，SOD、POD、PAL活性总体呈下降趋势，而CAT活性则表现出先降后升的趋势，前期快速下降，贮藏至8个月后又快速上升。与之相反，活性氧（超氧阴离子、H₂O₂）含量则表现出先升后降，贮藏前期逐渐升高，贮藏至8个月后又有所降低。从抗氧化酶和活性氧含量的变化来看，华重楼种子在贮藏前期处于休眠状态，种子活力下降，活性氧含量升高，贮藏至8个月后种子可能逐渐开始解除休眠，种子活力有所提高，活性氧含量降低。外种皮对种子贮藏过程中不同酶和活性氧含量的变化有一定的影响，说明外种皮中的内含物可能会影响相关抗氧化酶活性从而抑制种子萌发，这与赵燕等^[25]关于滇重楼种皮抑制物对种子萌发的研究结果相似。

植物内源激素对种子休眠和萌发具有重要的调节作用，一般研究认为赤霉素GA是解除种子休眠、促进种子萌发类的激素，而脱落酸ABA是促进种子休眠、抑制种子萌发类的激素^[16,26]，但也有研究认为解除种子休眠的促进物与诱导并维持种子休眠的抑制物存在一定的拮抗作用，保持激素含量的相对平衡也是调节种子休眠和萌发的一种内在机制^[27-28]。本试验表明，在华重楼种子贮藏过程中，生长类激素1-萘乙酸、赤霉素以及抑制生长类激素脱落酸的含量，均随贮藏时间的延长而逐渐下降。这说明赤霉素、1-萘乙酸对华重楼种子的萌发进程影响不大，而生长类激素吲哚乙酸随贮藏过程的延长而升高，说明吲哚乙酸可能是促进华重楼种子萌发的重要内源激素，且保留外种皮有利于其含量升高。随着研究的不断深入，反式玉米素、玉米素核苷、二氢玉米素、激动素均为细胞分裂素，对种子萌发过程的作用被逐渐发现^[29]。本试验中带种皮与去种皮种子中细胞分裂素在贮藏过程中含量均下降，说明该过程中种子处于休眠状态，未萌动。

3.2   结论

华重楼外种皮对种子贮藏过程中抗氧化性酶活性、活性氧和内源激素等生理生化指标的变化有一定影响。贮藏过程中，抗氧化酶活性降低，导致内源活性氧含量上升，使种子活力下降，处于休眠状态，而带种皮加剧了这一变化，因此带种皮种子不利于种子萌发。内源激素方面，随着贮藏时间的延长细胞分裂素、赤霉素3、1-萘乙酸、赤霉素7、脱落酸，水杨酸和茉莉酸均显著降低，而吲哚乙酸则随着贮藏时间的延长含量显著增加，说明华重楼种子的萌发可能与吲哚乙酸含量相关。