Blood Expression Profile in Blood and Correlation Analysis of β-defensin Gene in Crested Ibis （Nippion nippion）
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摘要:
由于种群瓶颈效应，出现朱鹮Nippion nippion人工育种受精率低和雏鸟存活率低等现象，从而限制了其重引入工作，亟须从分子层面对朱鹮的免疫情况作进一步研究。防御素是重要的免疫效应分子，在生物体抗菌及适应环境的过程中发挥着重要作用，但目前缺少对朱鹮种群β-防御素基因表达的研究。本研究以浙江德清下渚湖朱鹮繁育基地的74只朱鹮为研究对象，以其外周血为研究样品，通过实时荧光定量PCR检测了朱鹮11个β-防御素基因的血液表达水平，构建了浙江朱鹮种群血液β-防御素基因表达谱，并对广泛表达的AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7基因表达情况进行分析。结果表明：（1）5个广泛表达的AvBD基因相对表达水平在两两之间呈现极显著的正相关（P<0.01）；（2）朱鹮幼鸟血液的AvBD的相对表达水平高于亚成体及成鸟，推测其在幼鸟生长发育和适应环境中发挥重要作用；（3）亲代朱鹮与子代朱鹮的AvBD表现出中度至高度的正相关。本研究结果对于筛选具有较强免疫力的朱鹮个体、组建野化放归种群具有指导意义。
Abstract:The reintroduction efforts for the crested ibis (Nipponia nippon) have been hampered by a population bottleneck, leading to low fertility rates and poor chick survival during artificial breeding programs. This highlights the urgent need for molecular-level research into their immune mechanisms. Among these mechanisms, defensins are critical immune effector molecules that play a key role in antibacterial defense and environmental adaptability. However, there is a notable lack of research on the expression of β-defensin genes in crested ibis populations. To address this gap, we investigated β-defensin gene expression using peripheral blood samples from 74 crested ibises housed at the Xiazhuhu Crested Ibis Breeding Center in Deqing, Zhejiang Province. The expression levels of 11 β-defensin genes were measured using real-time fluorescence quantitative PCR, focusing on the widely expressed genes AvBD1α, AvBD2, AvBD3, AvBD4, and AvBD7. The analysis revealed the following key findings: 1. The relative expression levels of the five widely expressed AvBD genes were significantly and positively correlated with one another. 2. The relative expression levels of AvBD genes were higher in young birds compared to subadults and adults, suggesting that these genes play a crucial role in the growth, development, and environmental adaptation of young ibises. 3. The expression levels of AvBD genes showed moderate to high positive correlations between parent and offspring birds. These findings provide valuable insights for identifying individual crested ibises with robust immunity and hold practical significance for forming rewilding populations to support conservation and reintroduction efforts.
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Keywords:
- β-defencin /
- crested ibis /
- population /
- expression profile
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野生动物是许多病原体的天然宿主，病原体与宿主之间存在不可避免的协同进化。动物机体主要依靠体内完善的免疫程序和一系列的免疫反应来抵抗病原体的入侵和挑战，从而维持内环境的稳态和个体的健康[1]。因此，深入了解动物个体的免疫机制是利用和保护该物种的重要前提。
朱鹮Nippion nippion是国家Ⅰ级重点保护鸟类，是《“十四五”林业草原保护发展规划纲要》中抢救性保护珍稀濒危野生动物的关键物种之一。据国家林业和草原局朱鹮保护国家创新联盟统计，截至2023年11月，朱鹮从7只奠基者个体到现在种群破万只。目前关于朱鹮的诸多基因组学研究均提示，种群遭受严重的瓶颈效应，其遗传多样性极为匮乏[2-4]，这使得对朱鹮的免疫及繁育的研究尤为紧迫。
防御素具有直接抗菌、调控炎症反应及充当趋化因子三方面功能。防御素不仅是机体天然免疫的重要组成[5]，而且能够增强获得性免疫防御，是连接先天性和适应性免疫的关键因素[6]。已被证实，鸟类中β-防御素与抵抗禽致病性大肠杆菌Escherichia coli[7]、新城疫病毒密切相关[8]。β-防御素还能作为卵巢癌诊断和治疗效应检测的生物标记[9]。环境中存在的多种致病细菌及病毒都将导致朱鹮群体性感染疾病[10]。在抵抗病原体入侵和适应环境的过程中，朱鹮的β-防御素作为典型的先天免疫效应分子，可能充当了重要角色。目前，关于朱鹮防御素的研究仅涉及β-防御素基因解析[11]，尚缺少群体性的防御素基因表达谱的研究。
本研究基于朱鹮防御素基因簇数据建立能够有效扩增朱鹮β-防御素基因的扩增体系，确定各个基因的表达情况，筛选出广泛表达的β-防御素基因；并分析影响β-防御素基因表达的相关因素，旨在为进一步提高朱鹮的免疫相关保护工作提供科学依据和支持。
1. 材料与方法
1.1 样品
组织样本来源于濒危野生动物基因资源国家保护中心，包括朱鹮的心脏、肝脏、脾脏、大脑及肌肉等18个组织，用于实时荧光定量PCR（qPCR）引物筛选。
种群样品来源于浙江省德清下渚湖朱鹮繁育基地。所有个体前期饲养条件和处理保持一致，均为室内笼舍。共74只个体，其中老龄个体（≥13岁）5只，青壮年个体（2～13岁，包含2岁）24 只，亚成体（1～2岁，不包含2岁）21只，幼鸟（≤1岁）23只，未知年龄的朱鹮1只。样本性别比雌性（F）∶雄性（M）为 41∶33。静脉采血保存。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取和反转录
采用TRIzol® Reagent提取朱鹮组织和血液RNA，利用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（TaKaRa）反转成cDNA后于−20 ℃保存，用于后续定量表达实验。
1.2.2 QPCR引物筛选及扩增
我们的前期研究已完整地解析了朱鹮的β-防御素基因簇：14个β-防御素基因形成一段长约129 kb的基因簇。利用这一β-防御素基因簇序列（GenBank KM098134.1），以朱鹮β-防御素mRNA完整的编码区为模板序列，针对朱鹮的β-防御素基因分别设计引物；利用组织cDNA混合液为模板，筛选适用于qPCR的特异引物。扩增产物经直接测序后鉴定是否能够有效扩增目的基因（表1）。
表 1 朱鹮β-防御素基因特异性引物Table 1. Primers used in this study, including the primers of β-defensing genes in crested ibis.基因名称 参考序列ID 引物（5'－3'） 扩增长度/bp 退火温度/ ℃ AvBD1α KM272304.1 F: CCAACACCTTCTTCAGCC 144 59 R: CGATGACATTGTTCCTTATTT AvBD2 KM272306.1 F: GCTCTTTTCTCTCCTCTT 136 52.5 R: GCAACTTCCAACTTTAAC AvBD3 KM272307.1 F: AGCCCTGTGAAGACCCA 96 60 R: GCTTCCTGCAGCACCCT AvBD4 KM272308.1 F: CAAAACCTCAAAAACCTT 148 52.3 R: ATCCTGTGCAATTAACCA AvBD5（V5） KM272309.1、
KM272310.1F: CTGTGCTTTCCTCCTCCTAATG 145 52 R: CTCAGAGCAAATGCCAACG AvBD7 KM272311.1 F: ACCGTATTACTGGATTGGA 127 52 R: GTGATTCAGAAGCCGTTCA AvBD8 KM272312.1 F: TCTTTGCTGTTCTCCTCTT 129 55 R: ACCTCGTATTGGGTAGATT AvBD9 KM272313.1 F: AGGCTGCTCCCGCTTAC 115 60 R: CGGCAGGTCCCAATGTC AvBD10 KM272314.1 F: AGGCTGCTCCAGGTTCT 158 54 R: CTTTGCCAAAATCTTCG AvBD13 KM272316.1 F: CTCCAGGATGTTCACGC 173 60 R: GCTGGTCACTAGGGTCTGTC AvBD14 KM272315.1 F: TTCCTGCTGCTGCTTCTC 84 55.9 R: ACACTTGCCCTTGGTCTT HMBS 管家基因 F: TTTACCATTGGTGCTGTCT 91 60 R: GAAGGAGGCTCAGTGTTTT 2467F/2530R 性别鉴定 F: CGTCAGTTTCCCTTTCAG 358/552 52 R:CCAGTGCTTGTTTCCTCA QPCR采用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）进行。扩增体系为2× SuperReal PreMix Plus （SYBR Green） 5 μL，正反向引物各（10 μM） 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补充至10 μL。每对引物重复3个孔，基因相对表达水平根据2−△△Ct方法计算，以HMBS作为管家基因进行计算。
以能够有效扩增的β-防御素基因的特异性引物对血液cDNA样品进行qPCR，筛选出普遍表达的β-防御素基因，筛选标准为：有表达的个体数占研究样本总数的80%以上。表达数据应用于后期比较分析。
1.2.3 朱鹮β-防御素基因表达相关性分析
本研究分析了性别和年龄因素对于β-防御素基因表达是否存在显著差异，采用单因素方差（ANOVA）分析性别间是否存在差异，采用LSD多重比较分析四个年龄段的组间差异。同时利用繁育基地中记录的亲子关系，采用Pearson’s相关系数判断亲代与子代间β-防御素基因相对表达水平的相关性。
2. 结果与分析
2.1 朱鹮β-防御素基因特异性扩增体系的建立
利用混合cDNA样品进行引物筛选后，设计的11对β-防御素基因引物均能扩增出清晰的条带，并且扩增产物测序结果与目的片段序列一致，qPCR实验中得到的熔解曲线为单一尖锐峰（图1A），可用于后续实验，具体引物见表1。扩增效率和内参基因保持在一致范围内，符合qPCR相对定量实验的要求。但经多次尝试，并没有筛选到AvBD1β、AvBD11及AvBD12三个防御素基因的有效特异性引物，因此没有将这三个防御素基因列入本研究内容中。
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图 1 β-防御素基因（A）AvBD4 特异引物的熔解曲线，（B）朱鹮种群血液表达情况，（C）表达水平的相关性分析，（D）△Ct 值Figure 1. β-defencin genes（A） Melt curve of specific primer of AvBD4, （B） Gene expression profile of β-defensin in the blood of crested ibis population, （C） Person’s correlation coefficient of gene expression, and （D） Delta Ct value.2.2 朱鹮血液中普遍表达的β-防御素基因筛选
11对β-防御素基因特异性引物的qPCR结果显示，AvBD8、AvBD10及AvBD13在血液中无表达，推测为非表达性基因位点；AvBD5（4.1%）、AvBD9（27%）及AvBD14（37.8%）仅在少量个体中表达，为低表达性基因位点。确定普遍表达的β-防御素基因为5个，分别为AvBD1α（89.2%）、AvBD2（100%）、AvBD3（100%）、AvBD4（100%）及AvBD7（83.8%）（图1B）。在接下来的分析中，均采用这5个普遍表达β-防御素基因进行。
采用Person’s检测发现这5个基因的表达模式存在极显著相关（P<0.001）（图1C）。在种群中，这5个基因整体表达水平都低于管家基因HMBS （图1D）。以AvBD3的相对表达水平（平均△Ct）最高为7.9，其次为AvBD2和AvBD4（分别为8.1和8.3），而AvBD1α和AvBD7则相对表达较低（分别为10.1和10.4），并且个体间差异也很大。
2.3 普遍表达的β-防御素基因表达水平相关性分析
首先，针对性别是否影响β-防御素基因的相对表达水平，结果表明，除了AvBD1α之外，雌性朱鹮血液中β-防御素基因AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7的相对表达量均值高于雄性朱鹮，但这种表达差异均未达到显著水平（P>0.05）（图2A）。
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图 2 朱鹮不同组别（A）性别、（B）年龄段和（C）亚成体及成鸟与幼鸟之间β-防御素基因相对表达量比较。Figure 2. Comparison of relative expression of β-defensin genes in different groups （A） sex, （B） age and （C） subadults and between adult and juvenile birds of crested ibis.其次，不同年龄段的个体血液β-防御素基因的相对表达水平存在差异（图2B）。幼鸟（<1岁）的防御素基因表达水平最高，体现在AvBD2和AvBD3的表达显著高于青壮年和亚成体（P<0.05）；AvBD4的表达最高，但并未显著；AvBD7的相对表达显著高于亚成体（P<0.05）。若将年龄段分组调整为幼鸟、非幼鸟（亚成体和成鸟）两个组，结果表明AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7的相对表达情况均为幼鸟组高于非幼鸟组，AvBD2的表达水平在不同组间具有显著差异（P<0.05，图2C）。
第三，针对具有完整亲子信息的个体（47只）数据分析β-防御素基因表达水平。通过Pearson相关系数分析，数据表明亲代与子代血液β-防御素基因的相对表达水平为中度至高度正相关（相关系数大部分都在0.5～1之间，其中34个组合中7对组合表达水平相关性达到显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）水平。
3. 讨论
本研究成功建立了朱鹮β-防御素基因的特异性qPCR扩增体系，并且筛选出5个普遍表达的β-防御素基因，分析了性别和年龄因素对β-防御素基因相关水平的影响，并发现了β-防御素基因表达水平在亲代和子代之间的正相关性。
3.1 朱鹮的AVBD基因存在差异表达，其中广泛表达的AvBD3、AvBD2和AvBD4是人工种群重要先天免疫基因
β-防御素是一类古老的基因家族，被认为起源于至少520万年前，在无脊椎动物及头索动物中都发现同源基因[12]。鸟类具有14个AvBD基因亚家族，在32个不同目中都存在[13]。但在不同鸟类中，β-防御素基因数目存在差异，尤其是雀形目Passeriformes出现了基因重复事件[14]。在鹌鹑Coturnix japonica中发现不同AvBD单倍型存在基因拷贝数差异，这一特点可能也导致了先天免疫的潜在功能变化[15]。而作为维持功能性抗菌功效作用的β-防御素基因的多态性非常低，在水禽的群体调查中发现种群和物种水平上都体现出净化选择[16]。在歌带鹀Melospiza melodia的群体分化研究中，发现β-防御素基因体现的群体分化低于TLR基因，这同样说明了β-防御素基因的净化选择[17]。
在本研究中，我们发现朱鹮个体中β-防御素基因存在差异表达，其中AvBD2、AvBD2和AvBD4在所有个体的血液样本中均能检测到表达，而其他AVBD基因仅在部分个体中有所发现。根据Lan发表的朱鹮β-防御素基因簇结构[11]，可以发现这三个完全表达的AvBD基因遗传距离较其他基因近，推测可能存在共进化过程。鉴于β-防御素基因的抗菌效应为浓度依赖型[18-19]，因此推测在朱鹮个体中先天免疫的主要效应分子为这三个完全表达的AvBD基因，并且其他AvBD基因起到辅助作用。在本研究中，我们发现朱鹮的整体AvBD基因表达水平较低（Ct 均值在26.3～28.7之间，和HMBS计算后△Ct 值在7.9～10.4，图1D ）。根据基因5’端是否含有转录因子结合位点，可以把β-防御素的表达情况分为组成型及诱导型表达两类[20-21]。前者在特定组织中持续表达，而后者表达需要细菌产物或促炎细胞因子的诱导[22]。因所涉及个体受到环境病原诱导的概率较小，推测未呈现高表达的朱鹮的AvBD基因为诱导型表达。
3.2 影响β防御素表达的因素分析及对于野外放归的参考意义
鸟类的β-防御素已被证实和细菌病原体耐药性相关。如鸡Gallus gallus的AvBD5中有5个SNPs和AvBD14中有4个SNP与沙门氏菌Salmonella Lignieres病易感性显著相关（P<0.05）[22]；AvBD1在被艾美球虫Eimeria攻击后表现出显著差异[23]；输卵管中的防御系统直接影响蛋鸡的产蛋能力，而在对蛋鸡的研究中发现，老年母鸡子宫内AvBD基因含量较高[24]；AvBD2与宿主对细菌病原体的耐药性相关，被认为可作为个体先天性免疫能力的指标[25]。这些数据和研究结果都表明β防御素表达是个体先天性免疫能力的优良指标，对于动物的生存至关重要。
除了病原诱导外，年龄等因素也影响β-防御素表达。在蛋鸡和肉鸡的卵黄发育过程中均发现，AvBD10从胚胎日起逐渐增加E7至E9至E13，随后递减至日孵化，后期的递减推测是为了个体快速发育做出的免疫系统的牺牲[26]。在本研究中，幼鸟的防御素基因的表达水平均高于亚成体及成鸟。采样的幼鸟个体为六七个月龄，处于快速生长发育的阶段和适应外界环境的阶段，这与鸡胚发育早期β-防御素表达显著增加的结果一致[27]，但在对朱鹮研究中并未体现出免疫系统为了发育做出的协调。比较朱鹮生长阶段的β防御素基因的表达情况，发现亚成体个体免疫力较弱。因此，建议要多关注这一年龄段朱鹮的健康状况，提高饲养环境消毒灭菌的频率，同时需避免与其他家禽家畜或游客接触，防止其患病[28]。
通过亲代与子代之间比较分析，我们还发现它们之间的β-防御素基因存在正相关性。目前对于朱鹮野化放归种群的筛选（德清下渚湖朱鹮繁育基地的一项重要工作），主要以微卫星及MHC的多态性作为分子标记。而本研究结果说明，β-防御素基因同样可以作为遗传标记，筛选具有较强免疫力的朱鹮个体作为野化放归种群的储备，保存及延续朱鹮优质遗传资源。
4. 结论
本研究首次成功建立了朱鹮β防御素基因的特异性qPCR扩增体系，并通过检测血液中基因的表达情况发现AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4 及 AvBD7基因广泛表达。通过分组比较，发现幼鸟阶段的防御素表达明显高于其他阶段，亲本和子代之间的防御素表达情况存在相关性。以上结果将为朱鹮种群野外放归个体的筛选提供理论依据和实践基础。
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图 1 β-防御素基因（A）AvBD4 特异引物的熔解曲线，（B）朱鹮种群血液表达情况，（C）表达水平的相关性分析，（D）△Ct 值
Figure 1. β-defencin genes（A） Melt curve of specific primer of AvBD4, （B） Gene expression profile of β-defensin in the blood of crested ibis population, （C） Person’s correlation coefficient of gene expression, and （D） Delta Ct value.
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图 2 朱鹮不同组别（A）性别、（B）年龄段和（C）亚成体及成鸟与幼鸟之间β-防御素基因相对表达量比较。
Figure 2. Comparison of relative expression of β-defensin genes in different groups （A） sex, （B） age and （C） subadults and between adult and juvenile birds of crested ibis.
表 1 朱鹮β-防御素基因特异性引物
Table 1 Primers used in this study, including the primers of β-defensing genes in crested ibis.
基因名称 参考序列ID 引物（5'－3'） 扩增长度/bp 退火温度/ ℃ AvBD1α KM272304.1 F: CCAACACCTTCTTCAGCC 144 59 R: CGATGACATTGTTCCTTATTT AvBD2 KM272306.1 F: GCTCTTTTCTCTCCTCTT 136 52.5 R: GCAACTTCCAACTTTAAC AvBD3 KM272307.1 F: AGCCCTGTGAAGACCCA 96 60 R: GCTTCCTGCAGCACCCT AvBD4 KM272308.1 F: CAAAACCTCAAAAACCTT 148 52.3 R: ATCCTGTGCAATTAACCA AvBD5（V5） KM272309.1、
KM272310.1F: CTGTGCTTTCCTCCTCCTAATG 145 52 R: CTCAGAGCAAATGCCAACG AvBD7 KM272311.1 F: ACCGTATTACTGGATTGGA 127 52 R: GTGATTCAGAAGCCGTTCA AvBD8 KM272312.1 F: TCTTTGCTGTTCTCCTCTT 129 55 R: ACCTCGTATTGGGTAGATT AvBD9 KM272313.1 F: AGGCTGCTCCCGCTTAC 115 60 R: CGGCAGGTCCCAATGTC AvBD10 KM272314.1 F: AGGCTGCTCCAGGTTCT 158 54 R: CTTTGCCAAAATCTTCG AvBD13 KM272316.1 F: CTCCAGGATGTTCACGC 173 60 R: GCTGGTCACTAGGGTCTGTC AvBD14 KM272315.1 F: TTCCTGCTGCTGCTTCTC 84 55.9 R: ACACTTGCCCTTGGTCTT HMBS 管家基因 F: TTTACCATTGGTGCTGTCT 91 60 R: GAAGGAGGCTCAGTGTTTT 2467F/2530R 性别鉴定 F: CGTCAGTTTCCCTTTCAG 358/552 52 R:CCAGTGCTTGTTTCCTCA 
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