钙是植物生长发育的必需营养元素之一^[1]，根据其在植物体内是否与配体结合，将植物体内钙的存在形式分为自由离子态和结合态两种^[2]。自由离子态钙即Ca²⁺，结合态钙是与草酸、磷酸等小分子有机酸及简单分子配体结合或是与蛋白质酶、多糖、脂质等生物大分子复合物结合呈现，如草酸钙、磷酸钙、磷脂钙等。草酸是一种二元羧酸，广布于日常食物中的蔬菜、瓜果和谷物中，主要以水溶性草酸 （草酸钠和草酸钾）和难溶的草酸钙结晶的形式存在，当水溶性草酸积累到一定量就易形成草酸钙^[3]。草酸钙是植物中最常见的生物矿物^[4-5]，常以晶体的形式存在，由于株体草酸含量差异，植株中草酸钙含量不尽相同^[6]。水溶性草酸易进入体液循环系统，一旦人体内草酸过量，可导致高草酸尿症^[7]，并将与Ca²⁺结合形成难溶的草酸钙沉淀。若在肾脏中沉积将导致草酸钙肾结石，与人类的健康关系较为密切^[8]。可见研究分析蔬菜中的钙、草酸形态和含量对科学合理食用具有重要意义。

已有研究表明藜麦Chenopodium quinoa叶片富含钙、镁、钾、多酚和黄酮等多种有益物质^[9-12]，藜麦播种后生长至20～30 cm的藜麦幼嫩茎叶即可食用^[13-14]，且在人体微量元素摄取补充方面的优势要优于藜麦米^[15]。20世纪90年代初，中国就已将藜麦引种栽培^[16]，目前已在甘肃、青海、河北、吉林、内蒙古等多地区大面积种植，主要品种（种）有‘陇藜1号’‘青藜4号’‘冀藜2号’和东北红藜等^[17]，已成为区域性特色经济作物^[18]。藜麦叶片生长过程对环境条件的要求较收获籽粒的藜麦更为宽泛，浙江、湖南、天津等省（市）已有藜麦栽培报道^[19-21]。随着人们对食品健康要求的不断提高和对藜麦叶菜的认可，藜麦或将作为良品蔬菜进入大众视野。藜麦与菠菜 Spinacia oleracea同科，叶片中也有较高含量的草酸。一方面，草酸会与钙元素结合形成草酸钙，从而影响钙元素的吸收；另一方面，随着藜麦的生长，草酸和钙元素的含量也会不断地发生变化，在食用藜麦时，需要根据藜麦的生长阶段和草酸含量的变化，合理搭配食用，以提高钙元素的吸收利用率。本文拟通过对藜麦叶片生长期钙元素及草酸含量动态进行跟踪分析，旨在为藜麦菜的科学食用提供技术参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

选择‘陇藜1号’Ch. Quinoa‘Longli 1 ’‘青藜4号’Ch. Quinoa‘Qingli 4’‘冀藜2号’Ch. Quinoa‘Jili 1’和红藜Ch. formosanum 4种浙江省主栽的藜属植物为试验材料，种子由中国农业科学院提供。

1.2   试验地概况

试验于 2020年 9—12月在浙江省林业科学研究院试验田 （30.2170°E ， 120.0257°N）进行。试验地气候属于亚热带季风气候，四季分明，雨量充沛，全年平均气温为17.8 ℃，年平均相对湿度为70.3%，年均降水量为1 454 mm，年日照时数为1 765 h。

1.3   试验设计

采用随机区组设计，每个品种（种）6次重复，共24个小区，各试验小区间隔1 m，面积为0.5 m×0.5 m。藜麦种植采用覆膜穴播方式，播种深度为 1.5 cm，播种时间为2020 年 9月 15日。出苗后视苗情对缺苗处进行补苗。当藜麦苗长至4～6叶时进行间苗，长至7～10 叶时进行定苗，田间管理同常规大田管理。待藜麦苗长于4～6叶时开始采摘叶片，之后每隔6～7天取样。取样时间分别为9月30日、10月6日、10月12日、10月18日、10月24日、10月30日。连续取样6次后，叶片开始有失水现象，之后叶片已不宜食用，遂再间隔60 d于12月30日取第7次样品（干样，备用）。每次取样后即编号、制样、冰冻（−18 ℃）存放，完成全部取样后对藜麦叶中的钙和草酸含量进行统一测定分析。

1.4   仪器与试剂

仪器：PERKIN ELMER NEXION300X等离子发射光谱质谱仪， DIONEX ICS-2000离子色谱系统（包括KOH淋洗液发生器，ASRS-ULTRA阴离子抑制器，DS电导检测器，Chromeleon 6.8色谱工作站），SQP电子天平，SHR-C水浴恒温振荡器（江苏省金坛市环宇科学仪器厂），Milli-Q超纯水系统（电阻率18.2MΩ.cm），IKA MS3 basic旋涡混合器，微孔滤膜（0.45 µm，水相）。

试剂：盐酸（GR）、硝酸（GR）、高氯酸（GR）、甲醇（色谱纯）等，源自国药集团化学试剂有限公司，超纯水（自制）。

1.5   钙元素分析

1.5.1   游离钙（Ca²⁺）含量测定

采用水浸提法：称取样品1 g（精确至0.001 g）于100 mL小烧杯中，加入20 mL高纯水浸泡，液面淹没叶片，用封口膜封住杯口，常温震荡提取12 h后，过滤，滤液用25 mL容量瓶收集，瓶中加入6 mol·L⁻¹的盐酸2 mL，使溶液含酸约10%，用高纯水定容，摇匀待测。

1.5.2   结合钙含量测定

结合钙分为两部分，即以盐酸溶液为主提取的部分无机钙和以硝酸为主提取的有机钙^[22]。

盐酸提取：向用水浸提后的滤渣中加入盐酸溶液（盐酸∶水=1∶3）10 mL，在低温电炉上微沸15～20 min，稍冷，过滤，在滤渣内再加10 mL上述盐酸溶液，微沸15～20 min，冷却过滤，两次滤液合并到25 mL容量瓶内，定容待测。

硝酸消化：向用盐酸提取后的滤渣内加入10 mL硝酸，浸泡12 h，样品呈红灰色粘稠状，置于低温炉上小火加热使滤渣全部溶解，稍冷再加入5 mL硝酸和3 mL高氯酸，继续加热使二氧化氮慢慢逸出，试样溶解完全，溶液变澄清透明（如果在硝酸蒸尽之前有机物仍未全部溶解，要补加硝酸）。继续升温加热至高氯酸沸腾，溶液冒浓白烟，剩余约5 mL，取下冷却，收集于25 mL容量瓶中，定容摇匀待测。

样品中钙含量分析前的处理主要参考汤秀梅等^[22]的方法，后续采用电感耦合等离子体发射光谱（ICP/MS）进行定量分析，将分析试样与标准溶液（0.50 mg·L⁻¹、1.00 mg·L⁻¹、2.00 mg·L⁻¹、4.00 mg·L⁻¹、10.0 mg·L⁻¹）同时测定，求钙各形态的含量。光谱条件如表1所示。

表  1  ICP/MS检测技术参数

Table  1.  Technical parameters for ICP/MS detection

参数	条件		参数	条件		参数	条件		参数	条件
射频功率	1 450 W		氦气流量	4.2 L·min−1		采样深度	10 mm		采集检测	自动跳峰
等离子体气体流量	15 L·min−1		雾化室温度	2 ℃		蠕动泵转速	0.3 r·s−1		重复次数	3次
载气流量	0.8 L·min−1		雾化器	高盐		测定点数	1个		分析模式	碰撞
辅助气流量	0.5 L·min−1

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1.6   草酸含量分析

1.6.1   总草酸含量测定

称取样品0.5 g（精确至0.001 g）于100 mL离心管中，用 0.5 mol·L⁻¹ 的盐酸30 mL浸提20 min后离心、过微孔滤膜于100 mL容量瓶中，重复2次，合并3次提取液并定容待测。

1.6.2   水溶性草酸含量测定

称取样品0.5 g（精确至0.001 g）于100 mL离心管中，在沸水浴中用30 mL高纯水浸提20 min后离心，过微孔滤膜于100 mL容量瓶中，重复2次，合并3次提取液并定容待测。

样品中草酸含量分析前的处理主要参考李孟孟等^[23]的方法，采用离子色谱法进行定量分析，将分析试样与标准溶液（2.0 mg·L⁻¹、5.0 mg·L⁻¹、10 mg·L⁻¹、20 mg·L⁻¹、40 mg·L⁻¹）同时测定，计算草酸含量。

1.6.3   色谱条件

色谱条件：IonPac AS19分析柱（4 mm×250 mm，美国Thermo公司）、IonPac AG19保护柱（4 mm×50 mm，美国Thermo公司）；检测器：ASRS ULTRA 4 mm抑制电导检测器（美国Thermo公司），100 mA电流自动抑制循环模式。淋洗液：30 mM /L KOH；柱流速：1.0 mL·min⁻¹；温度：30 ℃；进样体积：25 µL。

1.7   组分计算方法

总钙=游离钙+结合钙

结合钙=盐酸溶液提取钙+硝酸消解后溶出的钙

无机钙=游离钙+盐酸溶液提取钙

溶出比=溶出量/总量×100%

1.8   数据分析

数据统计及分析用Excel 2016及SPSS 22.0软件，在P<0.05水平下分析差异显著性；制图采用Origin pro 2023软件。

2.   结果与分析

2.1   钙元素在藜麦叶片中各形态的含量分析

本研究中用水浸提测出的钙为游离态，用盐酸溶出的钙为无机态，用硝酸硝解得到的钙为有机态^[22]。测得钙元素含量结果均为可食用期内的平均值含量，即前6次所采样品测定结果的均值，如表2所示。由于第 7 次所采样品近为干品，已不宜食用，测得的钙含量和前 6 次测得的钙含量相差悬殊，故未在后续结果分析中体现。在藜麦叶片可食用期内，游离钙以‘青藜4号’叶片中的溶出比最高，达8.5%，其他3个品种（种）叶中的游离钙溶出比排序为红藜>‘冀藜2号’>‘陇藜1号’。 各品种（种）藜麦叶片中的结合钙占比均超过92%，是游离钙的10倍以上，占比最高的品种（种）是‘陇藜1号’，达97.2%，其后依次是‘冀藜2号’‘青藜4号’和红藜。各品种（种）藜麦叶片中的无机钙占比均高于有机钙，占比差最大的是‘冀藜2号’，达68.3%，无机钙占比是有机钙占比的5.8倍，其后依次是‘陇藜1号’‘青藜4号’和红藜。无机钙占比显著高于有机钙占比可能与藜麦中有机钙不断向无机钙转化、沉淀的结果有关。

表  2  钙元素在藜麦叶片中各形态的含量

Table  2.  Content of calcium elements in various forms in quinoa leaves

品种（种）	游离钙			结合钙
				无机钙			有机钙
	含量/（g·kg−1）	溶出比/%		含量/（g·kg−1）	溶出比/%		含量/（g·kg−1）	溶出比/%
‘陇藜1号’	0.044	2.7		1.316	82.2		0.240	15.0
‘冀藜2号’	0.057	3.5		1.361	82.4		0.233	14.1
‘青藜4号’	0.143	8.5		1.286	76.6		0.249	14.8
红藜	0.182	7.8		1.788	76.4		0.371	15.9

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2.2   钙元素含量动态分析

2.2.1   藜麦生长期叶片游离钙含量动态

Ca²⁺是植物重要的“第二信使”，参与响应多种逆境胁迫，如抗病、抗虫及非生物胁迫等^[24]，是维持细胞内离子动态平衡的重要组成部分^[25]。藜麦生长期叶片游离钙含量动态如图1所示，Ca²⁺含量总体呈不断增加的趋势，前期增幅大，后期增量大，10月18日前后是其Ca²⁺含量的增量拐点。其中，增量最大的是红藜，由0.026 g·kg⁻¹增至0.349 g·kg⁻¹，增幅达1242%；其次是‘青藜4号’，增幅为711%；‘冀藜2号’，增幅为421%；‘陇藜1号’增量相对较小，增幅仅为120%。可食用期Ca²⁺平均含量仍以红藜最高，达0.182 g·kg⁻¹，‘青藜4号’次之，‘陇藜1号’最小，仅为0.044 g·kg⁻¹。

图  1  藜麦生长期叶片Ca²⁺含量动态

Figure  1.  Dynamics of Ca²⁺ content in leaves of quinoa during growth period

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2.2.2   藜麦生长期叶片结合钙含量动态

钙进入植物体后有一部分会与植酸、果胶酸、蛋白质等有机物相结合，存在于细胞壁与细胞器中，在总钙含量中占据较大比重，这部分钙即为结合钙。结合钙在植物生长期间会根据实际需求，在特定的生理环境下有效转换钙的不同形式，参与株体能量代谢、有机物合成、物质转运、调节胞内pH值、稳定细胞内环境等诸多重要生理功能，同时产生乳酸钙、柠檬酸钙、苹果酸钙等有机酸钙及草酸钙、磷酸钙、氯化钙等难溶性无机钙^[26]。藜麦生长期叶片结合钙含量动态如图2所示，随着植株的生长，叶片中的结合钙含量均呈不断增加的趋势，增量最高的是‘冀藜2号’，由0.958 g·kg⁻¹增至1.887 g·kg⁻¹，增幅达96.9%。其次是‘陇藜1号’，由0.882 g·kg⁻¹增至1.451 g·kg⁻¹，增幅达95.2%。‘青藜4号’增幅相对较小，由0.869 g·kg⁻¹增至1.397 g·kg⁻¹，增幅为60.7%。叶片中结合钙平均含量最高的品种（种）是红藜，达2.16 g·kg⁻¹；‘冀藜2号’‘青藜4号’‘陇藜1号’叶片中结合钙的平均含量相近，均为1.55 g·kg⁻¹±0.05 g·kg⁻¹。在叶片可食用期间，结合钙含量变化趋势与Ca²⁺含量变化趋势相近，也呈前期增幅大，后期增量大的现象，10月18日前后是其增量拐点。

图  2  藜麦生长期叶片结合钙含量动态

Figure  2.  Dynamics of bound calcium content in leaves of quinoa during growth period

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2.3   草酸含量动态分析

2.3.1   藜麦生长期叶片水溶性草酸含量动态

草酸是植物维持株体pH值的最主要成分，在H⁺浓度高的时候，草酸的酸根可以结合多出来的H⁺；而当H⁺浓度降低的时候，草酸又可以释放出一些H⁺，以此来稳定植物体内的pH值。同时，草酸也是植物体内Ca²⁺浓度的调节剂，既可防止大量的钙进入细胞，影响植物正常的光合作用，又可在植物缺钙的时候，由草酸钙分解释放出钙离子，满足植物的生长所需。水溶性草酸是藜麦叶片中草酸的主要存在形式，平均含量为5.78 g·kg⁻¹，占总草酸含量的93.4%。图3为藜麦生长期叶片中水溶性草酸含量动态，由图可见其含量均随生长时间增加而减少，其中减量最大的是‘陇藜1号’，由6.80 g·kg⁻¹降至4.45 g·kg⁻¹，始末采样间可溶性草酸含量减少2.35 g·kg⁻¹。其次是‘青藜4号’，减少2.01 g·kg⁻¹，第三位是‘冀藜2号’，减少1.84 g·kg⁻¹，红藜减量最小，减少1.68 g·kg⁻¹。减幅最大的是‘陇藜1号’，达35%；其次是‘冀藜2号’，达28.6%；‘青藜4号’居第三位，为28.2%；红藜减幅最小，为24.1%。

图  3  藜麦生长期叶片水溶性草酸含量动态

Figure  3.  Dynamics of water soluble oxalic acid content in leaves of quinoa during growth period

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2.3.2   藜麦生长期叶片总草酸含量动态

总草酸在植物体内除以可溶态存在外，还以草酸钙、草酸镁、草酸铁等固体形态存在，是反映草酸在植物体内真实含量的指标。总草酸在藜麦生长期叶片中的动态含量如图4所示，总体趋势与水溶性草酸草酸含量变化趋势相似，生长期内含量仍呈不断下降趋势。其中减量最大的品种（种）仍是‘陇藜1号’，首次采样样品中总草酸含量比第 6 次采样的样品减少达2.85 g·kg⁻¹，其次是‘青藜4号’，减少2.63 g·kg⁻¹；‘冀藜2号’居第三位，减少2.51 g·kg⁻¹；红藜减量最小，减少1.64 g·kg⁻¹。减幅最大的是‘陇藜1号’，达37.0%，其次是‘冀藜2号’，达34.9%；‘青藜4号’居第三位，为33.7%，红藜最小，为23.0%。生长期内以固体形态存在的草酸平均含量仍以‘陇藜1号’最高，达0.65 g·kg⁻¹；其次是‘青藜4号’，达0.41 g·kg⁻¹；‘冀藜2号’居第三位，为0.41 g·kg⁻¹，红藜最小，为0.21 g·kg⁻¹。可见就草酸含量而言，红藜叶片更适合食用，其次是‘冀藜2号’‘青藜4号’‘陇藜1号’。

图  4  藜麦生长期叶片总草酸含量动态

Figure  4.  Dynamics of water soluble total oxalic acid content in leaves of quinoa during growth period

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2.4   不同形态钙和草酸相关性分析

对藜麦叶片中的可溶性草酸、总草酸与游离钙、无机钙、有机钙、总钙含量及生长时间的Pearson相关性进行分析，结果见表3。由表3表明，草酸含量和生长时间之间呈显著负相关（P<0.01），总钙含量与生长时间呈显著正相关（P<0.01），草酸含量与总钙含量呈显著负相关（P<0.01）。可溶草性酸和总草酸含量均与生长时间呈显著负相关（P<0.01）。相关性最强的是‘青藜4号’， 可溶性草酸和总草酸含量P值分别为0.001 9和0.000 4。游离钙含量与总钙含量呈显著正相关（P<0.01），与总草酸含量呈显著负相关（P<0.05）。无机钙含量同其它指标间相关性不具备一致性，如在‘陇藜1号’‘冀藜2号’叶片中无机钙含量同生长时间、游离钙含量、总钙含量呈显著正相关（P<0.01），与总草酸含量呈显著负相关（P<0.01），而在另两种藜麦叶片中无机钙含量同生长时间、游离钙含量、总钙含量无显著相关性。红藜叶片中有机钙含量与总草酸含量呈显著负相关（P<0.05），而其他三种成分的含量无显著相关（P>0.05）。

表  3  青藜叶草酸与钙含量Pearson相关性分析

Table  3.  Pearson correlation table between oxalic acid and calcium content in Quinoa ‘Qingli 4’ Ch leaves

		生长时间	游离钙	无机钙	有机钙	总钙	可溶草酸	总草酸
生长时间	Pearson 相关	1	0.916 7*	0.758 7	0.350 1	0.950 6**	−0.964 1**	−0.984 1**
	P值	−	0.010 1	0.080 3	0.496 3	0.003 6	0.0019	0.000 4
游离钙	Pearson 相关	0.916 7*	1	0.546 0	0.6118	0.932 6**	−0.88789*	−0.885 0*
	P值	0.010 1	−	2.622 3	0.1968	0.006 7	0.0182	0.019 1
盐酸无机钙	Pearson 相关	0.758 7	0.5460	1	−0.193 2	0.783 5	−0.7158	−0.760 0
	P值	0.080 3	2.622 3	−	0.713 8	0.065 3	0.1102	0.079 5
硝酸有机钙	Pearson 相关	0.350 1	0.611 8	−0.193 2	1	0.4373	−0.4356	−0.381 1
	P值	0.496 3	0.196 8	0.713 8	−	0.3859	0.388 0	0.456 0
总钙	Pearson 相关	0.950 6**	0.932 6**	0.783 5	0.437 3	1	−0.939 2**	−0.948 6**
	P值	0.0036 1	0.006 7	0.065 3	0.385 9	−	0.005 4	0.003 9
可溶性草酸	Pearson 相关	−0.964 1**	−0.887 9*	−0.715 8	−0.435 6	−0.939 2**	1	0.993 0**
	P值	0.001 9	0.018 2	0.110 2	0.388 0	0.005 4	−	0.000 1
总草酸	Pearson 相关	−0.984 1*	−0.885 0*	−0.760 0	−0.381 1	−0.948 6**	0.993 0*	1
	P值	0.000 4	0.019 1	0.079 5	0.456 0	0.003 9	0.000 1	−
注：“*”表示在0.05水平下相关性显著，“**”表示在0.01水平下相关性显著。

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3.   结论与讨论

通过对目前浙江省主要栽培的4种藜属植物叶片生长期钙元素与草酸含量动态分析研究，初步探明了藜麦叶片可食用阶段钙元素在叶片中存在形态的含量、可溶性草酸和总草酸的含量动态，以及钙含量和草酸含量间的相关性。

在藜麦叶片可食用期内，游离钙百分比由大到小排序为‘青藜4号’>红藜>‘冀藜2号’>‘陇藜1号’；结合钙占比由大到小排序是‘陇藜1号’>‘冀藜2号’>‘青藜4号’>红藜；无机钙占比均高于有机钙占比，占比差由大到小排序是‘冀藜2号’>‘陇藜1号’>‘青藜4号’>红藜。无机钙含量显著高于有机钙含量可能与藜麦中有机钙不断向无机钙转化、沉淀的结果有关。Ca²⁺含量总体呈不断增加的趋势，前期增幅大，后期增量大，10月18日前后是其增量拐点，其增量由大到小排序是红藜>‘青藜4号’>‘冀藜2号’>‘陇藜1号’，Ca²⁺平均含量由大到小排序是红藜>‘青藜4号’>‘冀藜2号’>‘陇藜1号’。叶片中Ca²⁺含量可能与含水量有关，随着藜麦的不断生长，叶片中水分含量逐渐减少，细胞受到水分胁迫影响，Ca²⁺作为渗透调节物质含量不断增加，且越接近叶片成熟和衰老期，这种现象越明显。结合钙含量变化趋势与Ca²⁺含量变化趋势相似，生长期内结合钙含量均呈不断增加趋势，增量由大到小排序是‘冀藜2号’>‘陇藜1号’>‘冀藜2号’>‘青藜4号’。结合钙平均含量是红藜最高，另3种藜麦品种含量相近。藜麦生长期叶片游离钙含量动态与刘帆等^[27]在玉米Zea mays 试验中的结果和与符云鹏等^[28]在香料烟叶Nicotiana tabacum 试验中的结果相近。

4种（品种）藜麦叶片中的可溶性草酸含量均低于菠菜叶片中的可溶性草酸含量，且均随生长时间增加而减少，其中初次取样样品与第6次取样样品减量由大到小排序是‘陇藜1号’>‘青藜4号’>‘冀藜2号’>红藜，减幅由大到小排序是‘陇藜1号’>‘冀藜2号’>‘青藜4号’>红藜。总草酸动态含量趋势与水溶性草酸动态含量趋势相似，呈不断下降趋势，其中减量由大到小排序是‘陇藜1号’>‘青藜4号’>‘冀藜2号’>红藜，减幅由大到小排序是‘陇藜1号’>‘冀藜2号’>‘青藜4号’>红藜。固体形态存在的草酸平均含量由大到小排序是‘陇藜1号’>‘青藜4号’>‘冀藜2号’>红藜。就草酸含量而言，红藜更适合食用，其次是‘冀藜2号’‘青藜4号’‘陇藜1号’。本研究4种（品种）藜麦叶片中的可溶性草酸含量变化趋势与张英鹏等^[29]在菠菜中的试验结果相近，叶片中水溶性草酸含量在生长期均不断减少。水溶性草酸是蔬菜中普遍存在的成分，含量偏高会严重影响食用口感，同时也可能给人体带来缺素症和肾结石等疾病。因此，藜麦叶片中水溶性草酸含量随生长期逐渐下降的趋势更有利于其被选作食品。草酸含量和生长时间呈显著负相关，总钙含量与生长时间呈显著正相关，草酸含量与钙含量呈显著负相关。在藜麦生长的中后期，其叶片中的草酸含量较低，而钙含量较高。因此，从营养价值和口感的角度来看，中后期的藜麦叶片更适合食用。